美女捕鱼短视频|美女捕鱼湿透
關于東納 About us
聯系我們
  • 客服服務電話:0755-2801 8888
  • 商業服務電話:18800000001
  • 技術服務電話:18800000001
  • 在線服務QQ:000000000
  • 服務郵箱:[email protected]
  • 網站:www.niumowang.com

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率

日期: 2019-07-09
瀏覽次數: 18

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率

五步解析磁轉染,深挖細節增效率

???

1952年,美國遺傳學家阿爾弗雷德?赫爾希(Alfred DayHershey)和瑪莎?蔡斯(Martha Cowles Chase)讓全世界認識了攜帶遺傳信息的DNA,掀開了基因時代的篇章。半個世紀過去了,基因測序技術發展的如火如荼,而基因轉染技術乃至于基因治療技術仍在摸爬滾打中艱難前行。

基因轉染是將特定的遺傳信息傳遞到真核細胞中的技術,需要攜帶信息的DNA及轉染試劑。常規基因轉染分為病毒載體法(生物學方法)及非病毒載體法(非生物學方法)。目前,轉染效率最高的是病毒,但病毒的毒性及免疫原性大大提高了其研究難度。非病毒載體,如陽離子脂質體、聚合物、納米磁珠等,雖然由于不具備病毒跨越細胞內障礙的能力,但其具有生物相容性好、可以大量生產的優勢,所以該類載體成為研究的熱點,其研究的重點就是提高轉染效率。

首先我們來認識下基因轉染的過程

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率

?

圖1 轉染過程簡圖[1]

?

A:攜帶信息的DNA與轉染試劑形成復合物。轉染試劑的選擇、緩沖液、pH、投料比、反應濃度都會影響最后復合物的大小及穩定性,進而影響之后的轉染效率。東納生物的MagTransfTM磁轉染磁珠表面修飾經過優選的陽離子聚合物,攜帶合適的正電荷,與負電荷的DNA通過靜電作用結合形成穩定的復合物,同時MagTransfTM表面還修飾有生物相容性高分子,以提高復合物的穩定性,并降低其毒性。

BDNA與轉染試劑的復合物靠近細胞膜。在這一過程中MagTransfTM因具備磁性,在磁場作用下快速沉降富集到細胞表面,復合物依靠靜電作用與電負性的細胞膜結合。MagTransfTM內核是經過優選的具有超順磁性的納米級磁珠,生物相容性優良,具有良好的分散性和膠體穩定性。

C:復合物被細胞內吞。內吞過程包括各種不同的途徑,這些不同的途徑可能影響生物活性分子向細胞質及細胞核的運輸。內吞泡的尺寸及細胞機制將細胞內吞分為以下三種類型:噬菌作用,吞入大小為0.25-10 μm的大顆粒;胞飲作用,內吞吸附在細胞膜上的大分子或顆粒物質;受體介導內吞,被內吞物為配體可與細胞表面的專一受體相結合引發內吞。這一過程中復合體的尺寸可能會影響細胞內吞的途徑,進而影響轉染效率。

D:溶酶體逃逸。由于溶酶體的pH值(5.0-6.2)較細胞質低(7.4)。因此,只有避免溶酶體、內吞體降解才能有效的提高轉染效率。而MagTransfTM表面陽離子聚合物因其“質子海綿效應”,當溶酶體內的pH下降時,能夠大量捕獲質子,并引起氯離子內流,導致溶酶體滲透性腫脹,最后溶酶體破裂從而將內吞的復合物釋放到細胞質中,同時,陽離子聚合物能夠保護DNA不被細胞質內的酶降解。

E:DNA進入細胞核。必須將DNA遞送到細胞核中以進入轉錄機制,所以DNA的核吸收是轉染的關鍵步驟。受核孔復合體(NPC)尺寸的限制,分子小于50kDa可以通過被動擴散自由地穿過NPC,但研究也發現載體DNA復合物可以在有絲分裂的時候進入細胞核[3],很多研究也證明細胞核內出現載體,同時也有研究認為載體攜帶的DNA有核定位功能,這些途徑都有助于成功實現DNA轉染。

上面我們簡單介紹了轉染試劑負載DNA進行轉染的過程,各個環節都會影響轉染的效果,那我們選擇合適的轉染試劑就能提高轉染效率了嗎,答案是沒那么簡單,下面我們將以東納生物的MagTransfTM磁轉染試劑為例講講轉染操作步驟中可以提高轉染效率的地方(以24孔貼壁細胞為例,其他培養皿按比例添加)。

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率

圖2 MagTransfTM磁轉染過程簡圖

?

1. 細胞鋪板:準備細胞0.5-2×105個細胞/500 μL,鋪板時注意邊緣效應。

a) 先用培養基潤濕培養皿后吸去培養基,避免細胞滴加的不均勻性。

b) 不同位置滴加細胞懸液,均勻鋪滿培養皿。

c) 8字混勻后在工作臺靜置1-2小時,直接進入培養箱會因溫度的變化引起邊緣效應,所以先讓細胞自然沉降在培養皿底部后再放入培養箱中培養。

d) 24小時后觀察細胞密度,達到70-90%時轉染效果較好。

2.DNA稀釋:

a) 選用高質量的DNA 1 μg(單孔)。如果自己提取DNA,建議使用去內毒素的質粒大提試劑盒提取,盡量獲得較高濃度的DNA,且無RNA污染,OD260/OD280大于1.8且小于2。

b) 使用無血清和無抗生素的培養基稀釋DNA,因為血清和抗生素可能會影響DNA與磁珠復合物形成。DNA稀釋后的反應濃度建議為10 μg/mL,或者更高,部分研究認為高反應濃度形成的復合物能有效的提高轉染效率[2]。

3.復合物孵育:取1 μL MagTransfTM磁轉染試劑(單孔),滴加入DNA稀釋液中,輕輕混勻,超凈工作臺靜置20分鐘。

筆者認為這一步很關鍵,不同的混合方式影響了形成復合物的大小及其空間結構,而不同的復合物大小及空間結構可能導致不同細胞內吞途徑,也許大的復合物可以不通過溶酶體而直接進入細胞質,反而有助于接近細胞核。關于復合物大小對轉染效率的影響的研究很多,但都未得到統一的認知,復合物的尺寸也許因細胞而異。

4. 轉染:

a) 細胞密度達到80%左右后,吸去上清,用PBS清洗細胞,加入一定體積的無血清無抗生素的培養基。

b) 將復合物不同位置滴加入細胞培養皿中,8字混勻,底部放上磁標板,放入CO2培養箱轉染20分鐘。

5. 培養:從培養箱中取出培養板,撤掉磁標板,根據細胞培養要求補加血清,然后放入CO2培養箱繼續培養。

6. 更換培養基及分析:細胞培養24小時后可更換為完全培養基,并可分析報告基因。

?

另外,MagTransfTM納米磁轉染載體表面陽離子聚合物與生物相容性高分子共修飾策略,大大增加了磁轉染載體負載基因后的分散性、膠體穩定性以及生物相容性,可以通過靜脈注射進行體內基因遞送研究,同時磁性納米顆粒還提供了磁共振成像示蹤的功能,這將進一步拓展你的研究工作。

基因轉染世界復雜而神秘。東納生物現提供免費的MagTransfTM磁轉染試劑試用裝,歡迎各位學者與我們一起探究基因轉染的世界,詳細信息請來函來電咨詢。

?

MagTransfTM磁轉染試劑介紹:

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率

東納學術課堂:五步解析磁轉染,深挖細節增效率


參考文獻:

[1] Luo D , Saltzman W M . Synthetic DNA delivery systems. Nature Biotechnology, 2000, 18(1):33-37.

[2] Zhang W, Kang X, Yuan B, et al. Nano-Structural Effects on Gene Transfection: Large, Botryoid-Shaped Nanoparticles Enhance DNA Delivery via Macropinocytosis and Effective Dissociation. Theranostics. 2019;9(6):1580–1598.

[3] Bai H, Lester GMS, Petishnok LC, Dean DA. Cytoplasmic transport and nuclear import of plasmid DNA. Biosci Rep. 2017;37(6):

?

“助力科研創新,幫助客戶成功”

?

南京東納生物科技有限公司

地址:南京市龍眠大道568 號,南京生命科技小鎮5號樓,電話:025-83475811

網址:www.zzhys.tw

?

?

?


上一篇:無下一篇:無
Hot News / 相關推薦
友情鏈接:
Copyright ?2017   南京東納生物科技有限公司
犀牛云提供云計算服務
X
3

SKYPE 設置

4

阿里旺旺設置

5

電話號碼管理

  • 025-83475811
6

二維碼管理

展開
美女捕鱼短视频 信誉最好的彩票网站 仲游娱乐平台 广东麻将技巧 开心11稳赚挂机模式 北京有北京时时么 足球彩票比分直播 万喜堂娱乐 看牌抢庄牛牛4张概率分析 快三稳赚技巧方法 牛牛稳赢公式